柯薩奇病毒A16型感染小鼠模型
討論與結(jié)論
采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經(jīng)腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發(fā)生后肢癱瘓最終導(dǎo)致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長(zhǎng)曲線（圖1B），臨床評(píng)分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時(shí)，2/7(28.57%)小鼠發(fā)生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時(shí)，4/7(57.14%)小鼠表現(xiàn)癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現(xiàn)死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現(xiàn)癱瘓后遺癥。
1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測(cè)
為了進(jìn)一步探討重癥EV71小鼠模型體內(nèi)病毒載量情況，采用RT-PCR對(duì)3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)（圖3），發(fā)現(xiàn)以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測(cè)到EV71病毒，其中，檢測(cè)到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測(cè)到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說(shuō)明5 dpi EV71病毒造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無(wú)明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測(cè)到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說(shuō)明這些組織是病毒復(fù)制并傳播到腦組織的重要部位。
2.重癥小鼠模型組織病理學(xué)變化
運(yùn)用組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)重癥小鼠模型的各組織器官進(jìn)行病理學(xué)觀察。空白對(duì)照組小鼠未見(jiàn)明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應(yīng)。
對(duì)重癥小鼠模型（NX10-147）進(jìn)行組織病理學(xué)觀察（圖4），發(fā)現(xiàn)3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發(fā)生嚴(yán)重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要有淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發(fā)生細(xì)胞源性水腫，神經(jīng)元發(fā)生變性，偶見(jiàn)壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性壞死，出現(xiàn)紅色神經(jīng)元，并可見(jiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象和嗜神經(jīng)現(xiàn)象，腦干組織中的神經(jīng)元發(fā)生不同程度的變性壞死，并且可見(jiàn)腦干和脊髓神經(jīng)元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發(fā)生大面積間質(zhì)性肺炎，間質(zhì)增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔毛細(xì)血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發(fā)生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生大面積空泡變性。免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在上述嚴(yán)重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時(shí)，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測(cè)到較強(qiáng)的陽(yáng)性EV71抗原信號(hào)，提示在這些組織中病毒復(fù)制活躍，然而在5 dpi時(shí)，肺臟檢測(cè)到中等強(qiáng)度陽(yáng)性EV71抗原信號(hào)。
3.重癥小鼠模型血清細(xì)胞因子檢測(cè)
對(duì)重癥小鼠模型進(jìn)行血清細(xì)胞因子檢測(cè)從血清細(xì)胞因子方面揭示重癥發(fā)生機(jī)制。本研究采用CBA方法檢測(cè)了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動(dòng)態(tài)變化（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發(fā)生某時(shí)間點(diǎn)的爆發(fā)性濃度增高，與空白對(duì)照組小鼠血清因子相比，發(fā)現(xiàn)重癥小鼠血清爆發(fā)性增高的細(xì)胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調(diào)4倍；48 hpi重癥IL-13上調(diào)1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調(diào)100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調(diào)9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時(shí)達(dá)到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調(diào)4倍和87倍。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實(shí)驗(yàn)感染早期炎癥反應(yīng)的主要因素，并且細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實(shí)驗(yàn)感染的免疫病理?yè)p傷中發(fā)揮重要作用。
4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血?dú)夥治?/strong>
對(duì)小鼠的氣道阻力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小鼠的吸氣時(shí)間延長(zhǎng)，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低（圖7），符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。
采用血?dú)夥治龇椒▽?duì)EV71重癥小鼠模型組和對(duì)照組小鼠的呼吸效果進(jìn)行分析，與對(duì)照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）（圖8A）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01）（圖8B），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態(tài)。并且發(fā)現(xiàn)二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）（圖8D）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L（圖8E），PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了血液酸堿度pH值和細(xì)胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）（圖8C）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05）（圖8F），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態(tài)。以上血?dú)饨Y(jié)果結(jié)合肺臟組織病理變化，說(shuō)明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態(tài)。
5. EV71小鼠模型超微病理學(xué)變化
對(duì)照組小鼠肌肉組織可見(jiàn)橫紋明顯，每條肌原纖維都可見(jiàn)清晰明帶和暗帶交替排列，肌質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復(fù)合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內(nèi)含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中（圖9A），肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)（圖9B）。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現(xiàn)為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發(fā)生退行性變，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)水腫，部分肌原纖維發(fā)生溶解，肌質(zhì)中的胞漿內(nèi)容物減少，糖原顆粒甚至消失（圖9C）；線粒體腫脹、空化，基質(zhì)電子密度降低，內(nèi)室腫脹，嵴和膜結(jié)構(gòu)模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化（圖9D）；骨骼肌細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，異染色質(zhì)明顯增多，發(fā)生變性、壞死。并且在肌纖維間可見(jiàn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
對(duì)照組腦組織中神經(jīng)元胞漿中的細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，平行或不規(guī)則排列，其間游離存在核糖體（圖10A）；線粒體豐富，散布于整個(gè)胞體中，線粒體內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰（圖10B）；腦組織中有髓神經(jīng)纖維髓鞘電子密度均勻（圖10C）。感染組腦組織超微病變輕微，神經(jīng)元細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，線粒體豐富（圖10D）；神經(jīng)元胞漿中可見(jiàn)少量空泡，部分線粒體內(nèi)室腫脹(圖10E)；有髓神經(jīng)纖維髓鞘發(fā)生層面分離，導(dǎo)致小泡性分離，呈現(xiàn)泡狀改變（圖10F）。
對(duì)照組脊髓前角神經(jīng)元常染色質(zhì)明顯，異染色質(zhì)少，細(xì)胞器豐富（圖11A）；脊髓前角神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)（圖11B）。感染組脊髓前角神經(jīng)元中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，出現(xiàn)尼氏小體溶解，核周見(jiàn)微空泡形成；胞核皺縮，異染色質(zhì)增多，細(xì)胞器減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體呈現(xiàn)不同程度的擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導(dǎo)致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數(shù)量減少（圖11C）。小膠質(zhì)細(xì)胞包圍吞噬神經(jīng)元細(xì)胞，呈現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象（圖11D）。
對(duì)照組肺組織中I型上皮細(xì)胞扁平，其細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)呈淺亮的常染色質(zhì)和呈深色顆粒狀的異染色質(zhì)，胞質(zhì)少而薄，胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量細(xì)胞器，與周圍細(xì)胞連接緊密（圖12A）；肺組織中的II型上皮細(xì)胞核大而圓，常染色質(zhì)細(xì)密，異染色質(zhì)少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、溶酶體等細(xì)胞器豐富（圖12B）；II型上皮細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體（圖12C）。感染組肺組織中I型上皮細(xì)胞核中染色質(zhì)邊集，呈不規(guī)則堆積，并且與周圍細(xì)胞之間連接松弛（圖12D）；肺組織中II型上皮細(xì)胞核形狀不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，核周細(xì)胞質(zhì)電子密度降低，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器減少，胞質(zhì)出現(xiàn)細(xì)小空泡變（圖12E），嗜鋨性板層小體或出現(xiàn)排空現(xiàn)象，溶酶體增多（圖12F）；肺泡壁中的細(xì)胞成分增多，其中肺泡II型上皮細(xì)胞增生，發(fā)生了間質(zhì)性肺炎。
生物安全性
H1PV為低于人間傳染病名錄三級(jí)安全風(fēng)險(xiǎn)的病原，人類感染風(fēng)險(xiǎn)低。
H1PV是大鼠必須排除的病原體，對(duì)動(dòng)物有致病性。會(huì)干擾其他實(shí)驗(yàn)研究。
鑒于此，此感染實(shí)驗(yàn)必須在BSL-2級(jí)以上的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)實(shí)驗(yàn)，在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
評(píng)價(jià)驗(yàn)證
1. 動(dòng)物癥狀觀察
動(dòng)物自感染后第3天開(kāi)始出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為體重增長(zhǎng)變緩、弓背豎毛、后肢行動(dòng)遲緩至癱瘓、死亡等癥狀（圖1）。感染后第4天時(shí)，動(dòng)物全部表現(xiàn)出后肢癱瘓、停止進(jìn)食等癥狀，感染后第5天動(dòng)物開(kāi)始出現(xiàn)死亡，在10天內(nèi)全部死亡。
2. 組織內(nèi)病毒復(fù)制情況
感染后最初在外周血中檢測(cè)到CA16病毒，隨后，血液中病毒載量逐漸下降。各組織中病毒載量在第3天和第5天達(dá)到高峰，其中骨骼肌內(nèi)病毒載量最高，在第3天可達(dá)到108 copies/mg組織，腦中病毒載量在第5天達(dá)到高峰，可達(dá)106 copies/mg組織，表明了病毒感染引發(fā)病毒血癥后，病毒經(jīng)血液向組織擴(kuò)散，并在組織內(nèi)復(fù)制。腦內(nèi)病毒的高峰期滯后于骨骼肌，表明病毒經(jīng)肌肉內(nèi)神經(jīng)元逆向軸突傳遞至腦內(nèi)，而非病毒經(jīng)血液直接擴(kuò)散至腦部（圖2）。
此外，在心臟、肝臟、肺、腎臟和脾中均可檢測(cè)到病毒核酸。
3. 病理改變
感染第5天時(shí)，處死動(dòng)物，觀察各組織的病理改變。小鼠的肺、腎和脊髓內(nèi)未見(jiàn)與病毒感染有關(guān)的病變。心臟內(nèi)表現(xiàn)為局灶性心肌纖維變性壞死，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肝內(nèi)局部肝細(xì)胞發(fā)生輕度空泡變性，可見(jiàn)肝實(shí)質(zhì)中發(fā)生輕度的髓外造血；脾臟髓外造血增多；骨骼肌的肌纖維腫脹、壞死斷裂、肌纖維之間可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，也可見(jiàn)巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞、壞死性肌炎；腦內(nèi)未見(jiàn)與病毒感染有關(guān)病變，發(fā)現(xiàn)輕度血管源性水腫，可能與缺血缺氧有關(guān)；部分腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性。
制備方法
SPF級(jí)1-10日齡乳鼠，ICR、C57或Balb/c均可。
1. 病毒準(zhǔn)備
CA16在人橫紋肌瘤細(xì)胞（RD）中培養(yǎng)、繁殖，采用凍融法釋放病毒，超速離心法富集病毒。毒株為shzh05-1，2008年分離自深圳市，GenBank存儲(chǔ)號(hào)為EU262658。
2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
可使用SPF級(jí)別的1-10日齡乳鼠，品系包括ICR、C57BL6J、Balb/c，母鼠自然哺乳，在動(dòng)物生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)獨(dú)立飼養(yǎng)。
3. 病毒感染
根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定感染劑量，10日齡乳鼠經(jīng)輕度麻醉后，經(jīng)腹腔注射2.5×107 TCID50 的CA16 shzh05-1,攻毒體積為100微升/只，空白對(duì)照組注射等量RD細(xì)胞上清。
4. 模型分析指標(biāo)
（1） 癥狀觀察
感染后動(dòng)物觀察14天，記錄體重變化、癥狀和死亡率。根據(jù)癥狀嚴(yán)重程度，參照以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行打分：
0，未見(jiàn)異常；1，豎毛；2，后肢遲緩無(wú)力；3.單后肢癱瘓；4，雙后肢癱瘓；5，死亡。
（2） 病毒檢測(cè)
分別在感染后第1天、3天、5天和7天處死動(dòng)物，分離主要組織器官，提取RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)組織內(nèi)病毒載量，記錄病毒復(fù)制情況。PCR引物序列為：CA16-F1: GAAAAACCCTCGACACACTAG；CA16-R1: ATCAGCGTCCTTGCAATACTCG (1095)
（3） 病理診斷
分別在感染后第3天、5天處死動(dòng)物，分離主要組織器官，HE染色觀察病理改變。
研究背景
手足口病是由腸道病毒引起的，以發(fā)熱和手、足、手足口病是流行于亞太地區(qū)的嬰幼兒常見(jiàn)傳染病。柯薩奇病毒A16型（CA16）和人腸道病毒71型（EV71）是手足口病的主要病原體之一，引發(fā)嬰幼兒手足口病及皰疹性咽峽炎，嚴(yán)重并發(fā)癥包括無(wú)菌性腦膜炎，而神經(jīng)源性的肺水腫或肺出血是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的原因之一。該病毒近年來(lái)在大陸地區(qū)的感染，已經(jīng)造成了數(shù)十萬(wàn)兒童感染，并不時(shí)伴隨有死亡病例，目前尚無(wú)臨床可以使用的疫苗和治療藥物。
CA16屬于微小RNA病毒科，腸道病毒屬。CA16感染主要引起自限性的手足口病，偶爾引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥包括無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心功能衰竭等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。
CA16主要通過(guò)糞口傳播，病毒最初定植于鼻咽部或胃腸道粘膜，侵入淋巴組織并在其中繁殖，進(jìn)而引起第一次病毒血癥。若機(jī)體免疫力差，病毒可擴(kuò)散至全身組織器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血癥，最終侵犯靶器官，如腦、腦膜、脊髓、心肌和橫紋肌以及皮膚黏膜組織，引起重癥病變。尸檢時(shí)主要病變?yōu)樯窠?jīng)元壞死等。
模型信息
中文名稱:柯薩奇病毒A16型感染小鼠模型
英文名稱:NA
類型:CA16感染動(dòng)物模型
分級(jí):NA
用途:用于手足口病研究。
研制單位:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所
保存單位:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所
