給予動(dòng)物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測(cè)，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺(tái)潛伏期顯著性延長(zhǎng)，避暗錯(cuò)誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實(shí)驗(yàn)還對(duì)CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對(duì)于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動(dòng)物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長(zhǎng)20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對(duì)飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測(cè)的特點(diǎn)，以避免動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過(guò)不同的刺激因子對(duì)老鼠造成慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激模型，通過(guò)水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對(duì)于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級(jí)老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物用水均經(jīng)過(guò)除菌處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無(wú)異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1. 物體認(rèn)知檢測(cè)結(jié)果

OVX小鼠8W時(shí)在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中其相對(duì)辨別指數(shù)顯著降低，即8W的模型動(dòng)物其對(duì)新舊物體的辨別能力降低。

圖2不同造模時(shí)長(zhǎng)的卵巢摘除模型物體認(rèn)知（新物體）能力情況

2. 避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與假手術(shù)組（Sham組）相比，OVX小鼠4W時(shí)在避暗實(shí)驗(yàn)中其入暗潛伏期顯著降低，錯(cuò)誤次數(shù)、暗室時(shí)間和明室近口區(qū)時(shí)間顯著增加。

圖3不同造模時(shí)長(zhǎng)的卵巢摘除模型在避暗實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)-暗室時(shí)間

圖4不同造模時(shí)長(zhǎng)的卵巢摘除模型在避暗實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)-錯(cuò)誤次數(shù)

3. 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

OVX小鼠8W時(shí)在水迷宮中工作記憶實(shí)驗(yàn)的潛伏期顯著增加，8W時(shí)模型動(dòng)物的空間工作記憶能力出現(xiàn)損傷。

圖5不同造模時(shí)長(zhǎng)的卵巢摘除模型在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)-工作記憶潛伏期

雌性ICR小鼠或者C57Bl/6雌鼠，8-12周齡，造成參考記憶障礙造模時(shí)長(zhǎng)需4周以上。常規(guī)飼養(yǎng)。

1. 卵巢摘除術(shù)

結(jié)合Merle E及常艷報(bào)道的小鼠卵巢摘除術(shù)的方法，操作步驟如下：小鼠稱重，4%水合氯醛溶液(400mg/kg bw)腹腔注射麻醉；將小鼠呈俯臥式固定于手術(shù)板上，以其兩側(cè)后肢大腿根部上緣連線與背部正中線交點(diǎn)以上0.5cm左右為中心，沿背部后中線作一長(zhǎng)約0.5-1cm的皮膚切口；沿皮下組織向左側(cè)游離大約0.5cm，可見(jiàn)菲薄的肌層下方發(fā)亮的脂肪組織；用鑷子提起脂肪團(tuán)表面肌層，縱行剪開(kāi)肌層，在脂肪組織中找到左側(cè)卵巢；結(jié)扎子宮角末端，摘除左側(cè)卵巢、輸卵管和一小部分子宮角，縫合剪開(kāi)的肌層；同法向右游離切除右側(cè)卵巢；最后縫合背部皮膚；假手術(shù)組除不摘除卵巢外其余操作和模型組相同；術(shù)后24h以后對(duì)小鼠行至少連續(xù)5天的陰道涂片檢查，判斷卵巢摘除是否完全。

圖1卵巢摘除過(guò)程

2. 陰道涂片檢查

為評(píng)價(jià)卵巢摘除是否徹底，術(shù)后連續(xù)5天每天固定時(shí)間行陰道涂片檢查，方法如下：用小鼠灌胃針吸取大約兩滴生理鹽水，在小鼠陰道內(nèi)吸打3-4次；吸出適量陰道液置于96孔板中，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察；陰道細(xì)胞檢查結(jié)果角化細(xì)胞均不超過(guò)50%判定為卵巢摘除徹底。

3. 模型分析指標(biāo)

（1）物體認(rèn)知-新物體識(shí)別 實(shí)驗(yàn)過(guò)程分為3個(gè)階段：適應(yīng)期、熟悉期、測(cè)試期。適應(yīng)期為3天，每天將動(dòng)物背對(duì)箱體依次放入實(shí)驗(yàn)箱中部位置后開(kāi)始使之適應(yīng)實(shí)驗(yàn)箱環(huán)境10 min。適應(yīng)期結(jié)束后，次日進(jìn)行熟悉期和測(cè)試期。熟悉期，將兩個(gè)完全相同的物體放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)相鄰的磁鐵處固定，記錄小鼠5 min內(nèi)對(duì)兩物體的探索行為，比較動(dòng)物對(duì)熟悉物體A1和熟悉物體A2的探索時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物對(duì)物體所在位置是否存在偏愛(ài)性，用動(dòng)物對(duì)物體對(duì)的總探索時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物對(duì)物體的探索能力是否存在偏差。間隔30 min后開(kāi)始測(cè)試期，將其中一個(gè)熟悉物體變換為新物體，另一熟悉物體保持不變。記錄小鼠在測(cè)試期內(nèi)對(duì)新穎物體和原熟悉物體的探索時(shí)間，用相對(duì)辨別指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。相對(duì)辨別指數(shù)計(jì)算公式為DI = (N-F) /(N+F) ×100%，其中N（new）為動(dòng)物對(duì)新穎物體的探索時(shí)間，F(xiàn)（familiar）為動(dòng)物對(duì)原熟悉物體的探索時(shí)間。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為避免動(dòng)物對(duì)某一位置產(chǎn)生偏愛(ài)，物體的位置要相互平衡，以便減少實(shí)驗(yàn)誤差。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)反映的是動(dòng)物對(duì)物體辨別的短時(shí)、非空間記憶能力。

（2）避暗實(shí)驗(yàn) 避暗實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒類動(dòng)物趨暗避明的習(xí)性設(shè)計(jì)，當(dāng)動(dòng)物進(jìn)入暗室即遭足底電擊，反復(fù)數(shù)次后形成條件反射。該實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)嚙齒類動(dòng)物的短時(shí)學(xué)習(xí)記憶和再現(xiàn)能力。實(shí)驗(yàn)分為避暗學(xué)習(xí)Day1和避暗鞏固Day2兩個(gè)階段，歷時(shí)2d。

避暗學(xué)習(xí)階段Day1：首先將避暗實(shí)時(shí)在線軟件系統(tǒng)設(shè)置為：刺激電流1.5mA，刺激電壓30V，實(shí)驗(yàn)時(shí)間5min。接著在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物背朝通道小門(mén)放入明室自由活動(dòng)5min適應(yīng)測(cè)試箱體環(huán)境后取出。隨后開(kāi)始避暗學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)，在攝像頭識(shí)別到動(dòng)物第一次進(jìn)入暗室后，暗室柵欄開(kāi)始通電，動(dòng)物遭受電擊會(huì)逃到明室，持續(xù)5分鐘，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。避暗學(xué)習(xí)結(jié)束后立即將動(dòng)物放回睡眠干擾儀內(nèi)繼續(xù)睡眠干擾。

避暗鞏固階段Day2：避暗學(xué)習(xí)后24h進(jìn)行。參數(shù)設(shè)置同前。將動(dòng)物背朝通道小門(mén)放入明室立即開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，暗室即可通電，記錄5min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)(進(jìn)入暗室的次數(shù))，潛伏期(第一次從明室到暗室的時(shí)間)、暗室時(shí)間、明室時(shí)間、暗室路程等指標(biāo)評(píng)價(jià)動(dòng)物的避暗記憶再現(xiàn)能力。

（3）水迷宮實(shí)驗(yàn)

3.1 水迷宮空間記憶

迷宮分為 4 個(gè)象限，將平臺(tái)置于其中一個(gè)象限中央，作為實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物逃離水環(huán)境的唯一途徑， 空間記憶階段保持平臺(tái)位置固定不變。選擇其余 3 個(gè)象限作為動(dòng)物的入水點(diǎn)將動(dòng)物面向池壁放入水中，每天訓(xùn)練 3 次，每次變換入水點(diǎn)位置( 使動(dòng)物可分別從 3 個(gè)象限入水)，且每天所有動(dòng)物入水點(diǎn)的順序保持一致。每次訓(xùn)練前適應(yīng) 10 s，使動(dòng)物獲取并學(xué)習(xí)空間環(huán)境信息。設(shè)置檢測(cè)時(shí)間為 60s 后，將動(dòng)物放入水中，若動(dòng)物在 60 s 內(nèi)找到平臺(tái)，算作尋臺(tái)成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺(tái)上停留休息 10 s。若動(dòng)物在 60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，結(jié)束此次訓(xùn)練并記錄潛伏期為 60 s，并引導(dǎo)動(dòng)物靠近平臺(tái)使其在平臺(tái)上停留 10 s。每只動(dòng)物訓(xùn)練的時(shí)間間隔為 40 min。每天每只動(dòng)物 3 次訓(xùn)練學(xué)習(xí)的潛伏期平均值，作為評(píng)價(jià)動(dòng)物這一天學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。經(jīng)過(guò) 5d 的訓(xùn)練學(xué)習(xí)后，第 6 天撤去平臺(tái)， 進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將動(dòng)物從原平臺(tái)象限的對(duì)角象限面向池壁放入水中，檢測(cè)其在 60s 內(nèi)在原平臺(tái)象限的游程比、時(shí)間比，以及穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)，作為評(píng)價(jià)空間記憶能力的指標(biāo)。

3.2 水迷宮工作記憶

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日， 開(kāi)始工作記憶實(shí)驗(yàn)。工作記憶歷時(shí) 3d，分別將平臺(tái)置于其余 3 個(gè)不同象限中，每天變換平臺(tái)位置，同一天內(nèi)平臺(tái)位置保持不變。每天訓(xùn)練 3 次，依次從其余 3 個(gè)非平臺(tái)象限將動(dòng)物面朝池壁放入水中。訓(xùn)練前不予適應(yīng)， 其余同空間訓(xùn)練階段一致。計(jì)算 3 天中， 第 2 次訓(xùn)練潛伏期的平均值，作為評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

當(dāng)婦女進(jìn)入更年期后，卵巢功能降低，雌激素水平下降，雌激素對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)保護(hù)作用減弱，老年性癡呆等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)增加。目前常用的模擬更年期婦女雌激素低下的動(dòng)物模型是卵巢摘除模型（ovariectomy/oophorectomy，簡(jiǎn)稱ovx），可以很好的模擬更年期婦女雌激素低下的生理及病理狀態(tài)。