該模型通過(guò)埋植雌激素，進(jìn)而建立了皮膚型狼瘡動(dòng)物模型，主要是檢測(cè)其dsDNA，腎臟變化，結(jié)合皮膚癥狀變化，來(lái)確定狼瘡皮膚病模型的建立。目前國(guó)際上尚欠缺類似模型，創(chuàng)新點(diǎn)在于該模型可快速建立模型，屬于誘導(dǎo)性狼瘡皮膚病模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機(jī)制提供了工具。目前國(guó)際無(wú)報(bào)道。

無(wú)安全性問(wèn)題。

1. 動(dòng)物癥狀及病理觀察在藥物處理、撤藥 2 天后，以耳石周圍的 MI1、MI2、O1、O2、IO4 五個(gè)部位的神經(jīng)丘毛細(xì)胞作為主要觀察對(duì)象，發(fā)現(xiàn)這五個(gè)部位的神經(jīng)丘毛細(xì)胞均有不同數(shù)量的減少，同時(shí)側(cè)線神經(jīng)丘和毛細(xì)胞也有不同程度的減少（圖 1）；此外，處理組幼體的半規(guī)管和耳石結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常：卵圓囊變?yōu)閳A形，而圓囊變小且不規(guī)則（圖2）。另外，幼體的身體姿態(tài)靜止時(shí)失衡（圖 3）。這些癥狀均與人的位聽(tīng)功能損害表現(xiàn)相似。

圖 1. 慶大霉素對(duì)毛細(xì)胞的損傷(7 dpf)斑馬魚(yú)頭部和測(cè)線排列的神經(jīng)丘主要由“花瓣樣”排列的數(shù)個(gè)毛細(xì)胞組成。綠色熒光點(diǎn)顯示神經(jīng)丘內(nèi)的毛細(xì)胞。

圖 2. 三種氨基糖苷類藥物對(duì)斑馬魚(yú)半規(guī)管和耳囊結(jié)構(gòu)的損傷(5 dpf)

圖 3. 三種氨基糖苷類藥物處理導(dǎo)致斑馬魚(yú)幼體(5 dpf)身體姿態(tài)失衡5三種氨基糖苷類抗生素作用于斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育期，雖然孵化后撤除了藥物，但幼體仍顯現(xiàn)出嚴(yán)重的毛細(xì)胞損傷和數(shù)量減少，以及神經(jīng)丘缺失和排列紊亂。說(shuō)明這種耳毒性損傷難以恢復(fù)。2. 基因表達(dá)異常進(jìn)一步檢測(cè)早期聽(tīng)覺(jué)器官發(fā)育的四個(gè)重要基因 eya1、val、otx2、dlx6a 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示這三種氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致這些基因在 48 hpf 胚胎的表達(dá)水平不同程度的下降。推測(cè)這些基因的下調(diào)可能與斑馬魚(yú)幼體內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育的缺陷及聽(tīng)力缺陷相關(guān)（圖 4）。

圖 4. 三種氨基糖苷類藥物處理對(duì)斑馬魚(yú)耳發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型斑馬魚(yú) AB 或 TU 品系 5 dpf 幼體。斑馬魚(yú)的位聽(tīng)覺(jué)器官由相當(dāng)于哺乳動(dòng)物內(nèi)耳的耳囊及其附屬結(jié)構(gòu)構(gòu)成，包括神經(jīng)丘(有數(shù)個(gè)位于中心的毛細(xì)胞和圍繞在周圍的支持細(xì)胞構(gòu)成)、半規(guī)管和兩個(gè)耳囊（橢圓囊和圓囊，相當(dāng)于人的卵圓窗和圓窗），其功能與人類內(nèi)耳相同。另外，在斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)上的神經(jīng)丘毛細(xì)胞也具有位覺(jué)功能。斑馬魚(yú) 5-dpf 幼體直到成年，其對(duì)聲音的刺激域和頻寬是不變的。因此，斑馬魚(yú)的位聽(tīng)覺(jué)器官是研究位聽(tīng)覺(jué)的理想模型。

2. 造模化合物及其對(duì)斑馬魚(yú)的處理

造模藥：氨基糖苷類藥物：慶大霉素(Gentamycin)、新霉素(Neomycin)和鏈霉素(Streptomycin)。三種造模藥通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定給藥濃度梯度。均使用人工海水直接配置。將發(fā)育至 6 hpf 的斑馬魚(yú)胚胎暴露于上述三種氨基糖苷類藥液中，直至 72 hpf。撤去藥液，用正常飼養(yǎng)液清洗斑馬魚(yú)后，繼續(xù)發(fā)育至 5、6 dpf，進(jìn)行后續(xù)處理。

3. 模型分析指標(biāo)

（1） 癥狀觀察斑馬魚(yú)身體平衡失調(diào)和體位異常與其位覺(jué)功能損傷相關(guān)。正常斑馬魚(yú)的 5 dpf幼體靜止時(shí)體位為俯位。斑馬魚(yú)幼體在靜止時(shí)呈斜側(cè)位，或游動(dòng)姿態(tài)異常，均為體位失衡。

（2） 毛細(xì)胞損傷檢測(cè)取野生型和造模藥處理的斑馬魚(yú)幼體（6 dpf），分別浸入活體熒光染料 1 μMYo-Pro-1（Invitrogen）的人工海水中避光孵化 1 小時(shí)，將斑馬魚(yú)用人工海水洗三次，再將胚胎置于麻醉劑 MS222 (3-aminobenzoic acid ethylester, methanesulfonatesalt, Sigma) 0.1mg/ml 中，麻醉后在熒光顯微鏡下觀察毛細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量和排列，并拍攝、計(jì)數(shù)。

（3） 病理診斷顯微鏡下觀察活體幼體耳結(jié)構(gòu)的變化，包括半規(guī)管和耳囊形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。以同批野生型斑馬魚(yú)幼體為正常對(duì)照組，藥物處理組撤藥 2 天后，以耳石周圍的 MI1、MI2、O1、O2、IO4 五個(gè)部位的神經(jīng)丘毛細(xì)胞作為主要觀察對(duì)象，結(jié)合側(cè)線神經(jīng)丘和毛細(xì)胞的觀察、計(jì)數(shù)。以神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)量減少和毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常為病理診斷指標(biāo)。

（4）基因檢測(cè)RT-PCR 方法檢測(cè)聽(tīng)覺(jué)發(fā)育基因的轉(zhuǎn)錄水平：收集野生型和藥物不同濃度處理胚胎各 40 枚, 用 Trizol 提取總 RNA; 以 AMV 反轉(zhuǎn)酶反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 3Co.) 合成 cDNA1st 模板；進(jìn)行常規(guī) PCR。以 β-actin 基因作為內(nèi)參基因。PCR產(chǎn)物電泳, 凝膠成像分析儀拍照記錄。

一、疾病名稱

聽(tīng)力損傷 (Hearing impairment)

二、臨床發(fā)病機(jī)制及癥狀

耳功能損傷臨床癥狀主要有眩暈、平衡失調(diào)和耳鳴、耳聾。耳是人和脊椎動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)和平衡器官。內(nèi)耳和毛細(xì)胞是執(zhí)行這兩功能主要器官和細(xì)胞。人的內(nèi)耳包括前庭、半規(guī)管和耳蝸三部分。前庭和半規(guī)管是位覺(jué)感受器，負(fù)責(zé)感受體位和調(diào)節(jié)身體平衡；而耳蝸是聽(tīng)覺(jué)感受器，與聽(tīng)力相關(guān)；以及在它的外壁的兩個(gè)耳斑：卵圓窗和圓窗。位覺(jué)感受器受損的表現(xiàn)為眩暈、惡心、平衡失調(diào)和步態(tài)不穩(wěn)。聽(tīng)覺(jué)感受器受損的表現(xiàn)為耳聾。其損害的直接靶位為內(nèi)耳組織器官的毛細(xì)胞。藥物耳毒性是指藥物導(dǎo)致的內(nèi)耳損傷，這種損傷可以發(fā)生在耳蝸，前庭或/和聽(tīng)神經(jīng)。藥物耳毒性可以是可逆性的如阿司匹林等，也可導(dǎo)致永久性耳聾如氨基糖苷類和一些抗癌藥如卡鉑，順鉑等。有研究報(bào)道，我國(guó)約 100 萬(wàn)以上的聾啞兒童中 2/3 是濫用耳毒性藥物所致。大量的調(diào)查數(shù)據(jù)和研究報(bào)道證實(shí)，氨基糖甙類抗生素藥物的耳毒性致聾不僅位于國(guó)內(nèi)藥物致聾的首位，而且是導(dǎo)致新生兒先天和后天性耳聾以及成人耳聾的各種致聾因素排位之首。

三、模式動(dòng)物

斑馬魚(yú)(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。